NEB CRISPR 基因編輯
——CRISPR/Cas9、C12a(Cpf1)核酸酶，sgRNA合成試劑盒，突變檢測試劑盒
北京澤平代理美國進(jìn)口New England Biolabs (NEB) 公司CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12a(Cpf1)基因編輯產(chǎn)品，包含Cas9核酸酶、Cas12a(Cpf1)核酸酶、sgRNA合成試劑盒、突變檢測試劑盒/T7核酸內(nèi)切酶I等，靈活滿足不同基因編輯需求。
一、Cas9核酸酶、Cas12a(Cpf1)核酸酶
CRISPR核酸酶系統(tǒng)（核酸酶和gRNA）的簡單性，使該系統(tǒng)具有良好的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用價(jià)值�；蚪M斷裂處通過容易出現(xiàn)錯(cuò)配的非同源末端連接 （NHEJ） 或同源定向重組 （HDR） 兩種方式來激活修復(fù)過程。在提供有與目標(biāo)基因座同源的供體模板的情況下，HDR途徑被激活，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)突變。在沒有模板的情況下，NHEJ被激活，導(dǎo)致插入或缺失（indels），從而改造目標(biāo)區(qū)域。
直接導(dǎo)入Cas9/sgRNA復(fù)合物或Cas12a(Cpf1)/sgRNA復(fù)合物可更高效地進(jìn)行基因編輯，簡化了CRISPR/Cas研究的實(shí)驗(yàn)流程，能提高誘變活性、降低脫靶效應(yīng)。NEB為Cas RNP 復(fù)合物方法提供高純度帶有核定位序列的Cas9核酸酶和Cas12a(Cpf1)核酸酶。
NEB克隆自釀膿鏈球菌的Cas9核酸酶（A）和克隆自稻蝗科細(xì)菌N2006的Lba Cas12a（B）的序列識別和DNA切割示意圖。
二、sgRNA合成
1、Cas9基因編輯實(shí)驗(yàn)中除了Cas9酶外，還需要向?qū)NA。sgRNA包含20個(gè)堿基序列，位于固定的支架序列上游，與目標(biāo)序列特異互補(bǔ)。sgRNA可以通過體外合成獲得，也可以通過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄生成。NEB提供豐富試劑滿足不同sgRNA生成方式需求。
2、NEB EnGen sgRNA 合成試劑盒可以進(jìn)行模板合成與轉(zhuǎn)錄，在一個(gè)小時(shí)或更短的時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)錄毫克級別的sgRNA。單管反應(yīng)，操作簡便，僅需將單條約55nt的ssDNA靶標(biāo)特異性寡核苷酸模板與試劑盒里的反應(yīng)預(yù)混液和酶預(yù)混液混合即可完成反應(yīng)。轉(zhuǎn)錄的sgRNA適合多種下游應(yīng)用，如CRISPR/Cas9基因編輯、體外DNA切割等。單管反應(yīng)易于操作且減少了DNA擴(kuò)增和純化步驟。該試劑盒兼容NEB EnGen Spy Cas9 NLS、Cas9 Nuclease、EnGen Spy Cas9 Nickase、EnGen Spy dCas9 (SNAP-tag)等。
A. 目標(biāo)特異性序列包括T7啟動(dòng)子序列、約20nt目標(biāo)基因序列和與Cas9支架區(qū)寡核苷酸互補(bǔ)的14nt重疊序列（包含在反應(yīng)預(yù)混液里）。室溫下將目標(biāo)特異性序列與NEB EnGen 2X sgRNA 反應(yīng)預(yù)混液、EnGen sgRNA 酶預(yù)混液進(jìn)行混合。
B. 37℃ 下，14nt重疊互補(bǔ)序列退火。
C. DNA聚合酶在3'端開始延伸形成雙鏈DNA模板。
D. RNA聚合酶識別T7啟動(dòng)子，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，完成目標(biāo)特異性sgRNA的轉(zhuǎn)錄。所有反應(yīng)單管進(jìn)行，37℃孵育30min。
三、突變檢測試劑盒和T7核酸內(nèi)切酶I
T7核酸內(nèi)切酶I突變檢測分析是廣泛使用的鑒定突變的方法。該分析可檢測由DNA雙鏈退火產(chǎn)生的含特定突變的DNA鏈及野生型DNA鏈組成的異源雜交雙鏈。NEB EnGen 突變檢測試劑盒利用T7核酸內(nèi)切酶I對編輯效率進(jìn)行鑒定，試劑盒內(nèi)包含檢測所需的優(yōu)化試劑。
NEB EnGen 突變檢測試劑盒工作流程示意圖
圖. 用靶向引物對基因編輯修飾的基因組進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)變性和再退火產(chǎn)生三種不同的擴(kuò)增產(chǎn)物。用T7核酸內(nèi)切酶I消化PCR產(chǎn)物中含錯(cuò)配堿基的DNA雙鏈，然后電泳分離DNA，并進(jìn)行片段分析以評估編輯效率。
此外，在反應(yīng)體系中額外添加同源修復(fù)模板可以對Cas9編輯位點(diǎn)進(jìn)行靶向修飾。同源修復(fù)模板可以是質(zhì)�；蚬押塑账幔浜心繕�(biāo)序列附近同源區(qū)及想引入的突變序列。質(zhì)粒可用于“knock-in”篩選標(biāo)記或熒光標(biāo)簽等大片段插入序列。構(gòu)建質(zhì)粒時(shí)可用高保真聚合酶擴(kuò)增基因組上目標(biāo)區(qū)域附近的同源序列，然后克隆到質(zhì)粒骨架中。使用NEB Q5 超高保真DNA聚合酶擴(kuò)增同源序列，然后用NEB PCR Cloning Kit 進(jìn)行后續(xù)克隆�？梢允褂肗EBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix 進(jìn)行快速質(zhì)粒克隆組裝，對質(zhì)粒進(jìn)一步改造，或使用NEB Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit 進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變。
北京澤平代理的NEB基因編輯相關(guān)產(chǎn)品
| 產(chǎn)品名稱 |
CRISPC應(yīng)用 |
貨號 |
規(guī)格 |
| Cas9 Nuclease, S. pyogenes |
體外切割dsDNA，直接導(dǎo)入活性核酸酶復(fù)合物RNP進(jìn)行基因編輯 |
M0386S/T/M |
70/300/600pmol |
| EnGen Cas9 Nuclease NLS, S. pyogenes |
體外切割dsDNA，直接導(dǎo)入活性核酸酶復(fù)合物RNP進(jìn)行基因編輯 |
M0646T/M |
400/2000pmol |
| EnGen Lba Cas12a (CpfI) |
體外切割dsDNA，直接導(dǎo)入活性核酸酶復(fù)合物進(jìn)行基因編輯，識別5’-TTTN PAM 序列 |
M0653S/T |
400/2000pmol |
| EnGen Mutation Detection Kit |
基因編輯效率檢測 |
E3321S |
25rxns |
| EnGen Sau Cas9 |
體外切割dsDNA，直接導(dǎo)入活性核酸酶復(fù)合物RNP進(jìn)行基因編輯 |
M0654S/T |
70/400pmol |
| EnGen sgRNA Synthesis Kit |
毫克級別的特異性sgRNA制備 |
E3322S |
20rxns |
| EnGen Spy Cas9 Nickase |
體外切割dsDNA，直接導(dǎo)入活性核酸酶復(fù)合物RNP進(jìn)行基因編輯 |
M0650S/T |
400/700pmol |
| EnGen Spy dCas9 (SNAP-tag) |
體外結(jié)合DNA，與SNAP標(biāo)記底物合用，易于可視化和富集 |
M0652S/T |
400/700pmol |
| HiScribe T7 ARCA mRNA Kit |
制備帶ARCA帽的Cas9 mRNA |
E2060S/E2065S |
20rxns |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit |
制備sgRNA和Cas9 mRNA |
E2040S |
50rxns |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit |
制備sgRNA和Cas9 mRNA |
E2050S |
50rxns |
| Monarch RNA Cleanup Kit |
sgRNA和Cas9 mRNA 純化 |
T2040S/L |
10/100preps |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit |
單管、等溫合成基因編輯質(zhì)粒及HDR模板 |
E5520S |
10rxns |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix |
單管、等溫合成基因編輯質(zhì)粒及HDR模板 |
E2621S/L/X |
10/50/250rxns |
| Q5 High-fidelity DNA Polymerases |
高保真擴(kuò)增目的序列 |
多種 |
多種 |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix |
高保真擴(kuò)增目的序列 |
M0491S/L |
100/500units |
| Q5 Site-directed Mutagenesis Kit |
Cas9-sgRNA的靶序列插入及HDR模板修飾 |
E0554S/E0552S |
10rxns |
| T7 Endonuclease I |
基因編輯效率檢測 |
M0302S/L |
250/1250units |
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