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NEB qPCR、RT-PCR、RT-qPCR 試劑
——反轉錄酶/逆轉錄酶、預混液、試劑盒

 
北京澤平代理美國進口NEB（New England Biolabs）公司各類逆轉錄酶（反轉錄酶）、預混液、反轉錄試劑盒（逆轉錄試劑盒），提供Protoscript II 反轉錄酶、M-MuLV反轉錄酶、AMV逆轉錄酶、LunaScript反轉錄試劑盒等，用于cDNA合成、RT-PCR、一步法RT-qPCR、兩步法RT-qPCR、常規(guī)qPCR，適用于染料法、探針法檢測。NEB逆轉錄酶具備更高熱穩(wěn)定性、更強持續(xù)合成能力、擴增速度快、抑制劑耐受能力強，可用于高GC含量、復雜結構模板，應用于RNA直接測序、長片段cDNA測序、RT-LAMP等。



一、LunaScript反轉錄試劑盒（Luna反轉錄酶）——RT-qPCR、擴增子測序

1、NEB Luna反轉錄酶（Luna逆轉錄酶），作為RNA依賴型DNA聚合酶，耐高溫能力強，酶活性溫度為55℃~65℃，適用于高GC含量、復雜二級結構模板；持續(xù)合成能力強，具備很強的單次連續(xù)添加核苷酸的能力，可在非常短的時間內合成更長的cDNA鏈；提供多種預混液、試劑盒形式，用于不同模板來源的染料法、探針法RT-qPCR檢測。

·快速：反應時間非常短，<15min；
·耐高溫：55℃~65℃，適用于困難模板；
·穩(wěn)定：反轉錄酶預混液在25℃放置15天活性不損失；
·便捷：提供不同劑型、預混液，使用方便；
·可見：添加無干擾藍色示蹤染料，避免加樣失誤。
 

2、NEB LunaScript反轉錄SuperMix試劑盒 (逆轉錄試劑盒，LunaScript RT SuperMix Kit，貨號E3010) 包含優(yōu)化的反轉錄預混液、No-RT對照、無核酶水，可用于cDNA第一鏈合成、擴增子測序、兩步法RT-qPCR。LunaScript預混液含有熱穩(wěn)定Luna反轉錄酶，可在更高溫度下合成cDNA；提供小鼠RNase抑制劑，保護模板RNA不被降解；含有隨機六聚體引物、poly-dT引物，可均勻覆蓋整個RNA靶標；含有藍色染料，可在兩步法RT-qPCR起到示蹤作用；樣品起始量從高達1µg，到低至單拷貝RNA，均能得到穩(wěn)健、線性和靈敏的檢測結果。

·適合目標長度≤3kb的cDNA；
·單管預混液，含隨機六聚體引物、oligo-dT引物、dNTP、小鼠RNase抑制劑以及Luna反轉錄酶；
·15min內即可完成cDNA第一鏈合成；
·熱穩(wěn)定Luna反轉錄酶大大改善實驗表現；
·含無干擾、可視化藍色示蹤染料，減少加樣錯誤；
·含無核酶水、無反轉錄酶對照預混液。


圖. LunaScript反轉錄SuperMix預混液在兩步法RT-qPCR實驗中展現了出色的靈敏度、線性關系和重復性。在20μl反應體系中，使用1×LunaScript反轉錄SuperMix預混液，在標準反應條件下（25℃/2min，55℃/10min，95℃/1min）將RNA轉錄為cDNA。然后將Luna通用qPCR預混液和1μl cDNA 作為模板，對cDNA進行qPCR定量。每種起始量濃度做三個重復。
A. 將梯度稀釋的Jurkat總RNA（1μg~1pg）反轉錄為cDNA，然后通過qPCR對β-actin靶標進行定量。
B. ERCC（External RNA Controls Consortium）對照mix 1 RNA 包含50~5×10⁹拷貝的ERCC₀₀₁₃₀（約10ng~10fg），反轉錄為cDNA后通過qPCR進行定量。


圖. LunaScript反轉錄SuperMix預混液可覆蓋長轉錄本。設計八對引物覆蓋整個15.2kb HERC1 轉錄本。在20μl反應體系中，使用1×LunaScript反轉錄SuperMix混合液，在標準反應條件下（25℃/2min，55℃/10min，95℃/1min），將Jurkat總RNA（1μg~1ng）反轉錄為cDNA。然后將Luna通用qPCR預混液和1μl cDNA 產物作為模板，對cDNA覆蓋度進行qPCR評估。每個靶標的起始量濃度均做重復。

 
3、NEB LunaScript 反轉錄SuperMix預混液（逆轉錄預混液，LunaScript RT SuperMix，貨號M3010）相比LunaScript反轉錄SuperMix試劑盒，不含無反轉錄酶對照預混液和無核酶水。


4、NEB LunaScript 反轉錄預混液試劑盒（無引物） (逆轉錄試劑盒，LunaScript RT Master Mix Kit [Primer-free]，貨號E3025) 包含除引物外的合成cDNA第一鏈所需的所有組分，適用于RT-PCR、RNA-seq及其它應用，與隨機引物、oligo dT 引物以及基因特異性引物兼容，讓cDNA合成更靈活。

·5×預混液提供Luna反轉錄酶、dNTP、小鼠RNase抑制劑；
·不含引物劑型可更靈活選擇引物，達到更佳cDNA合成效果；
·15min內即可完成cDNA第一鏈合成；
·可用于cDNA第一鏈合成、兩步法RT-qPCR、兩步法RT-PCR、RNA-seq；
·包含無干擾、可視化藍色示蹤染料，減少加樣錯誤；
·提供無反轉錄酶對照預混液，增加實驗可信度。 


圖. 在兩步法RT-qPCR定量中，LunaScript反轉錄預混液試劑盒（無引物）性能穩(wěn)健。
A. 使用隨機引物混合液和LunaScript 反轉錄預混液（無引物）對1µg~100pg RNA 進行反轉錄，并進行兩步法RT-qPCR檢測，結果顯示：與LunaScript一致，合成cDNA產量均展現出良好的線性度。
B. 對于常規(guī)轉錄本，使用d(T)₂₃VN引物獲得的cDNA覆蓋度與隨機引物混合液一致。但對于長轉錄本（如SMG1），隨機引物混合液能更好地覆蓋靶基因5'端，右下角圖框所示RT-qPCR的靶基因位于SMG1（16kb）轉錄本的5'端。與隨機引物混合液（隨機六聚體引物和dT錨定引物的混合物）相比，單獨使用dT錨定引物[d(T)₂₃VN]的Cq值延遲。


圖. 在常規(guī)PCR或高保真PCR中，LunaScript反轉錄預混液試劑盒（無引物）能夠合成各種長度范圍cDNA。使用LunaScript反轉錄預混液試劑盒（無引物）將1µg Jurkat總RNA反轉錄成cDNA，引物為d(T)₂₃VN，使用標準反應條件55℃溫育10min，95℃溫育1min。之后使用不同PCR擴增試劑對cDNA合成產物進行檢測。對于5kb以內的常規(guī)應用，建議使用NEB OneTaq 2X 預混液；如需高保真，建議使用NEB Q5 熱啟動超保真2X預混液；如需長片段PCR擴增獲得更高產量，建議使用NEB LongAmp Taq 2X 預混液（數據未顯示）。


5、NEB LunaScript 一步法多重RT-PCR試劑盒（LunaScript Multiplex One-Step RT-PCR Kit，貨號E1555）為cDNA合成和PCR擴增提供了簡化方案。其中的5×反應預混液含有dNTP，適用于多重靶標檢測，操作便捷；25×酶預混液含有Luna WarmStart 反轉錄酶和Q5熱啟動超高保真DNA聚合酶；核酸適配體可逆結合上述兩種酶，在低于45℃下抑制酶活，對兩種酶活進行雙重溫控，支持在室溫下建立反應體系，防止非特異性擴增，預混體系可在室溫下穩(wěn)定保存24h。LunaScript一步法多重RT-PCR試劑盒具備強大的多重靶標擴增能力，適用于IVD、病原體檢測、病毒基因組測序等多種應用。

·含Luna WarmStart 反轉錄酶和Q5熱啟動超高保真DNA聚合酶；
·可檢測低至0.01pg的人總RNA；
·多重檢測能力適用于ARTIC測序方案；
·適配體允許室溫下建立反應體系，防止非特異性擴增，保持24h持久穩(wěn)定；
·在單獨的閉合試管中一步完成RT-PCR，節(jié)省時間、減少污染。
  

圖. 在單個RT-PCR反應中進行多重RNA靶標檢測和鑒定。LunaScript一步法多重RT-PCR試劑盒僅需添加RNA模板和基因特異性引物，即可在一次反應中對多個cDNA靶標進行合成和擴增。擴增后的cDNA產物可通過下游應用進行檢測或鑒定，包括：二代測序、DNA芯片、片段分析、電泳和傳統的克隆/測序。


圖. LunaScript試劑可在室溫下放置長達24h，在此期間RNA的檢測效果仍然靈敏和穩(wěn)定。使用LunaScript一步法多重RT-PCR試劑盒對GAPDH靶標（570bp）進行擴增，樣品為0.01ng~10ng的Jurkat總RNA。反應體系在冰上建立并立即運行（對照）或在熱循環(huán)前在室溫下放置1h、4h、24h。每個溫育條件下都設有無模板對照（NTC）反應。結果顯示：所有上樣量均完成了高度靈敏和特異的靶標擴增，預混體系在室溫下放置長達24h后也達到了同樣的效果。

 

 

NEB針對qPCR、RT-qPCR不同模板來源、檢測方法，提供經優(yōu)化的多種Luna預混液、試劑盒產品。

  


二、Induro反轉錄酶——RNA直接測序、長片段cDNA測序、復雜模板

NEB Induro 反轉錄酶（Induro逆轉錄酶，Induro Reverse Transcriptase，貨號M0681）是由II型內含子編碼的反轉錄酶，在RNA反轉錄合成cDNA過程中，展示出更強的持續(xù)合成能力、更強的熱穩(wěn)定性，以及抑制劑耐受能力，特別適合長轉錄本、復雜二級結構，以及含有抑制成分樣品。Induro反轉錄酶提升了長轉錄本的5'端測序覆蓋度，適用于RNA-seq，如RNA直接測序、長讀長cDNA測序。

·反轉錄延伸能力強，可擴增超過20kb；
·速度快，5min內合成>12b cDNA 全長產物；
·熱穩(wěn)定性更強，55℃~60℃高溫條件下合成cDNA更穩(wěn)定；
·強大的抑制劑耐受能力，耐KCI、NaCI、MgCl、福爾馬林、煤油、吐溫20、乙醇、異丙醇、DMSO等，使cDNA合成更穩(wěn)定；
·與源自逆轉錄病毒的反轉錄酶保真度相當；
·跨越修飾核苷酸能力，適用于直接RNA測序、長讀長cDNA測序實驗流程。


圖. Induro反轉錄酶的持續(xù)合成能力強，能夠快速高效合成cDNA。Induro反轉錄酶能夠在55℃條件下，5min內合成12kb cDNA 全長產物。以體外轉錄獲得的不同長度的poly(A) RNA 作為模板（1kb、4kb、8kb、12kb），驗證全長cDNA反轉錄效果。首先合成cDNA第一鏈，隨后用NaOH水解RNA鏈，將cDNA產物等分，分別加入5'特異性引物合成全長雙鏈cDNA。最后，在瓊脂糖凝膠上加入等體積的雙鏈cDNA產物進行檢測。


圖. Induro反轉錄酶熱穩(wěn)定性強大，能夠在更高反應溫度下穩(wěn)定合成。Induro反轉錄酶能夠在45℃~60℃條件下，10min內合成12kb cDNA 全長產物。以體外轉錄獲得的不同長度的poly(A) RNA 作為模板（1kb、4kb、8kb、12kb），驗證全長cDNA的合成效果。首先合成cDNA第一鏈，隨后用NaOH水解RNA鏈，將cDNA產物等分，分別加入5'特異性引物合成全長雙鏈cDNA。最后，在瓊脂糖凝膠上加入等體積的雙鏈cDNA產物進行檢測。


圖. Induro反轉錄酶能夠以復雜的人RNA為模板，反轉錄合成長片段cDNA。Induro反轉錄酶以人總RNA為模板，分別在50℃、55℃、60℃條件下，經10min溫育，合成超過14kb的cDNA產物。cDNA第一鏈合成后，將產物等分，使用NEB LongAmp Taq 2X 預混液進行PCR。

 

 
三、Protoscript II 反轉錄酶——常規(guī)RT-PCR、RT-qPCR、RNA-seq

1、NEB Protoscript II 反轉錄酶（Protoscript II 逆轉錄酶，ProtoScript II Reverse Transcriptase，貨號M0368）是一種重組M-MuLV反轉錄酶，具有非常低的RNase H 活性，避免長RNA模板過早降解，增強的熱穩(wěn)定性，可在比野生型M-MuLV更高的溫度下（48°C）合成cDNA第一鏈。Protoscript II 反轉錄酶提供更高的特異性、更高的cDNA產量、長達12kb的全長cDNA產物。

·重組M-MuLV反轉錄酶；
·非常低的RNase H 活性；
·提高熱穩(wěn)定性，在高達48℃時仍有活性。


圖. 即使起始RNA量非常少，也能生成高質量的cDNA。使用遞減量的Jurkat總RNA（1μg~1pg）和200units的NEB ProtoScript II 逆轉錄酶合成cDNA第一鏈（20μl體系），反應物在42°C下孵育50min，然后在80°C下熱滅活5min。使用LongAmp Taq 預混液將1μl cDNA 用于25μl體系PCR中，進行40個循環(huán)。靶標是GAPDH的0.6kb片段。Marker是NEB 2-Log DNA Ladder。


圖. 即使較長的模板，也能穩(wěn)定合成cDNA。使用200units NEB ProtoScript II 逆轉錄酶合成Jurkat總RNA（1μg）的cDNA第一鏈（20μl體系）。反應物在42°C下孵育50min，然后80°C下熱滅活5min。使用NEB LongAmp Taq 預混液將1μl cDNA 用于25μl PCR 中，進行35~40個循環(huán)。大小如凝膠上方所示。 


2、NEB ProtoScript II cDNA 第一鏈合成試劑盒（ProtoScript II First Strand cDNA Synthesis Kit，貨號E6560）含有經優(yōu)化的ProtoScript II 酶預混液、ProtoScript II 反應預混液、Oligo-dT引物、隨機引物、無核酸酶的水，可提高cDNA的特異性和產量。酶預混液含ProtoScript II 反轉錄酶、小鼠RNase抑制劑；反應預混液含dNTP、經優(yōu)化的緩沖液；Oligo-dT引物[d(T)₂₃VN]能與polyA尾的起始端退火；經優(yōu)化的隨機引物混合液能隨機并持續(xù)性地與整個RNA模板配對，包括mRNA與無polyA尾的RNA。ProtoScript II 反轉錄酶降低了RNase H 活性，提高了熱穩(wěn)定性，可在高達48℃的溫度下合成cDNA第一鏈，相比野生型具備更高特異性、更高cDNA產量，合成的cDNA第一鏈產物可達10kb。

·重組M-MuLV反轉錄酶，降低了RNase H 活性，提高了熱穩(wěn)定性（高達48℃時仍有活性）；
·可合成長達10kb的cDNA；
·含Oligo-dT引物、隨機引物混合液、無核酸酶水。


圖. 使用ProtoScript II cDNA 第一鏈合成試劑盒對JurkatRNA進行cDNA合成。42℃條件下，使用1× ProtoScript II 反應混合液和1× ProtoScript II 酶混合液，以250ng Jurkat 細胞總RNA，合成cDNA第一鏈。使用NEB LongAmp Taq 2X 預混液，擴增來自不同基因的四個擴增子。泳道1為來自SDHA基因的1.9kb擴增子；泳道2為來自鳥嘌呤核苷酸交換因子的5.5kb擴增子；泳道3為來自Xrn-1基因的7.3kb擴增子；泳道4為來自原纖維蛋白基因的9.2kb擴增子。DNA Marker M 為1kb Plus DNA Ladder。

 


四、WarmStart RTx 反轉錄酶——RT-LAMP

NEB WarmStart RTx 反轉錄酶（WarmStart RTx 逆轉錄酶，WarmStart RTx Reverse Transcriptase，貨號M0380）是一種由計算機設計的以RNA為模板的DNA聚合酶，具有完整的RNase H 活性，可使用RNA（cDNA合成）或單鏈DNA作為模板，通過引物合成互補的DNA鏈，專業(yè)用于擴增反應中RNA檢測，特別適合環(huán)介導等溫擴增LAMP。WarmStart技術添加可逆結合的適配體，可在40°C以下抑制反轉錄酶活性，實現室溫構建反應體系，提高結果一致性和特異性。另提供無甘油、凍干形式，用于微流控設備，實現自動化工作流程。

·環(huán)介導等溫擴增LAMP的理想選擇；
·WarmStart溫啟動技術有助于在室溫下、高通量建立反應體系，提高擴增反應的一致性和特異性。


圖. 提高RT-LAMP的速度和靈敏度。將NEB Bst 2.0 WarmStart DNA 聚合酶和WarmStart RTx 反轉錄酶在65°C下與1pg~100ng Jurkat 總RNA一起孵育。用實時熒光監(jiān)測反應，所得曲線顯示在左邊，相應的閾值時間顯示在右邊。WarmStart RTx 提供更短的反應閾值時間，能以較低的RNA起始量，獲得更高一致性和靈敏度。而使用AMV逆轉錄酶進行的RT-LAMP反應結果不一致，如較低RNA起始濃度下發(fā)生巨大變化（藍色曲線）。


圖. WarmStart RTx 的溫啟動控制。進行cDNA合成10min，然后進行qPCR分析。根據0%活性的“無反轉錄酶”對照和100%活性的最快Ct對所得Cts進行歸一化。WarmStart RTx 在低于40°C的溫度下被可逆結合的適配體抑制。

 


五、M-MuLV反轉錄酶——常規(guī)RT-PCR

NEB M-MuLV 反轉錄酶（M-MuLV逆轉錄酶，M-MuLV Reverse Transcriptase，MMLV，貨號M0253）是重組來源的莫洛尼氏鼠白血病病毒反轉錄酶，能以RNA（合成cDNA時）或單鏈DNA為模板，由引物起始，合成一條互補的DNA鏈，該重組酶通過基因工程改造在N端產生16個額外的氨基酸，在C端產生13個氨基酸，具備了RNase H 功能，無3'→5'核酸外切酶活性。

·重組來源；
·隨酶附10×反應緩沖液；
·不含DNase、RNase。

 


六、AMV反轉錄酶——常規(guī)RT-PCR

NEB AMV 反轉錄酶（AMV Reverse Transcriptase，貨號M0277），即禽骨髓母細胞瘤病毒（AMV）逆轉錄酶，能以RNA（合成cDNA）或單鏈DNA為模板，由引物起始，合成一條互補的DNA鏈。

·RT-PCR、cDNA合成、RNA測序的理想選擇；
·10×反應緩沖液可為cDNA第一鏈和第二鏈的穩(wěn)定合成提供更佳反應條件。

 

 
NEB反轉錄酶選擇表

 

 
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